دکتر سید سلمان فاطمی . نورولوژیست, [03/09/2024 12:13 ق.ظ]
سلول های بنیادی بویایی بینی انسان- که به عنوان محصولات دارویی درمانی خالص شده اند- تمایز نورونی و بیماری های مختلف عصبی از جمله آتاکسی مخچه ای و آسیب نخاعی را بهبود می بخشد.
خلاصه
زمینه
سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی ،(OE-MSC) سلول های بنیادی مزانشیمی هستند که از لایه پروپریای مخاط بینی مشتق می شوند. آنها خواص نوروژنیک و تعدیل کننده ی ایمنی را نشان می دهند و نشان داده شده است در مدل های حیوانی ترومای نخاعی، کاهش شنوایی، بیماری پارکینسون، فراموشی و آسیب اعصاب محیطی، باعث بهبودی می شود. به عنوان گامی به سوی عمل بالینی، ما به دنبال ایجاد یک پروتکل کشت بودیم که الزامات تعیین شده توسط آژانس های سلامت انسان را برآورده می کند ودر مرحله ی بعد، کارایی سلول های بنیادی را بر تمایز نورون ها ارزیابی می کنیم.
مواد و روش ها
بیوپسی مخاط بویایی بینی از سه اهداکننده برای طراحی و تایید فرآیند تولید و خالصسازی سلولهای بنیادی استفاده شد. تمام فرآیندها و روشها توسط کارکنان متخصص آزمایشگاه سلول درمانی بیمارستان دولتی مارسی (AP-HM)، با دستکاریهای استریل انجام شد. اماکن، مواد و هوا همیشه تمیز نگه داشته شدند تا از آلودگی متقابل، تصادف یا حتی تلفات جلوگیری شود. سلول های بنیادی خالص شده به مدت 24 یا 48 ساعت کشت شدند.
نتایج
در مقایسه با پروتکل مبتنی بر کشت ریزنمونه، هضم آنزیمی، تعداد سلول های بالاتری را سریعتر فراهم می کند و کمتر مستعد آلودگی است. سلول های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده، بازآرایی کروموزومی را نشان نمی دهند و همانطور که انتظار می رود، نشانگرهای فنوتیپی معمول سلول های بنیادی مزانشیمی را بیان می کنند. هنگامی که در محیط کشت استاندارد گنجانده می شود، محیط شرطی شده OE-MSCs خالص شده باعث تمایز سلولی سلول های نوروبلاستوما Neuro2a می شود.
نتیجه
ما یک فرآیند تولید ایمن تر و کارآمدتر برای سلول های بنیادی بویایی ایجاد کردیم. با این پروتکل، OE-MSCهای انسانی به زودی در فاز اول بالینی مبتنی بر پیوند اتولوگ آنها استفاده خواهند شد. با این حال، مطالعات بیشتری برای آشکار کردن مکانیسم های عمل مورد نیاز است.
معرفی
سلول های بنیادی مزانشیمی(MSC ) که در اولین کارآزمایی بالینی مبتنی بر سلول درمانی- که در اواسط دهه 1950 انجام شد- ( توماس و همکاران، 1957 )، زمینه جدیدی از مداخلات درمانی را گشودند. از آن زمان، صدها پیوند مبتنی بر MSC در طیف گسترده ای از بیماری ها یا تروما انجام شده است ( ژو و همکاران، 2021 ). سلول های بنیادی مزانشیمی در ابتدا محدود به مغز استخوان بودند، و بعدا در بافت های متعددی از جمله بند ناف، مایع آمنیوتیک، جفت، ماهیچه، کبد، پوست، صورت [برای بررسی ( Väänänen, 2005 )] و بسیاری دیگر مانند بافت چربی ( Maria et al., 2017 ) و خون قاعدگی ( چن و همکاران، 2019)دیده شد.
زیرشاخهای از سلولهای بنیادی مزانشیمی- که از تاج عصبی منشا میگیرند و بیشتر در صورت قرار دارند- جدا شده است و تحت نام سلولهای بنیادی اکتومزانشیمی طبقهبندی شدهاند. این سلولها که قبلاً پیشسازهای مزانشیمی-عصبی نامیده میشدند، میتوانند به انواع سلولهای اکتودرم و مزودرم تمایز یابند ( Calloni et al., 2009 ) و برای پزشکانی که مایل به ترمیم سیستم عصبی هستند، یک زیرگروه خاص - سلولهای بنیادی ecto-mesanchymal بویایی (OE). -MSC) - مورد توجه خاص است. سلول های بنیادی مزانشیمی OE-MSC متعلق به یک بافت عصبی هستند و در نوروژنز دائمی که در تمام طول عمر در مخاط بویایی انجام می شود، درگیر هستند ( Graziadei and Graziadei, 1979 ). این بافت که در حفره بینی قرار دارد، به راحتی در افراد مراقب، تحت بیحسی موضعی بیوپسی میشود ( Girard et al., 2011 ).
تا پایان قرن گذشته، اجداد چند توانی که قادر به ایجاد سلول های عصبی و غیر عصبی بودند از جوندگان ( هوارد و همکاران، 1998 ) و انسان جدا شدند ( رویزن و همکاران، 2001 ؛ مورل و همکاران، 2005 ). مخاط بویایی بعداً، این پیش سازها به عنوان عضوی از خانواده سلول های بنیادی اکتومزانشیمی با نوروژنیک مشخص شدند ( Delorme et al., 2010 ) و فنوتیپ OE-MSCs به طور گسترده مشخص شد.
این نوع جدید از سلول های بنیادی، که ترکیبی از برخی ویژگی های سلول های بنیادی مزانشیمی و سلول های بنیادی عصبی است، کاندیدای خوبی برای آزمایش های سلول درمانی است، همانطور که در مدل های بیماری پارکینسون ( مورل و همکاران، 2008 )، ناشنوایی ( یانگ و همکاران، 2018 ) و فراموشی نشان داده شده است ( Nivet et al., 2011 ). سلول های بنیادی مزانشیمی OE-MSC به سلول های عصبی تمایز می یابند ( Murrell et al., 2008 ; Delorme et al., 2010 ; Nivet et al., 2011 ) و اعمال تعدیل کننده ی ایمنی انجام می دهند ( Di Trapani et al., 2013 ) و عوامل متعددی را در رشد آکسون ترشح می کنند.
دکتر سید سلمان فاطمی . نورولوژیست, [03/09/2024 12:13 ق.ظ]
راهنمایی ( ژیرارد و همکاران، 2017 ). همچنین در شرایط آزمایشگاهی نشان داه شد چگونه آنها می توانند از سد خونی مغز عبور کنند ( Girard et al., 2017 ) و به نورون های دوپامینرژیک متمایز شوند ( چابرات و همکاران، 2019).
طراحی مطالعه و صلاحیت اهداکننده
در سال 2019، یک مطالعه آیندهنگر با هدف اعتبارسنجی ساخت OE-MSC با استفاده از شیوههای تولید ( کمیسیون اروپایی، 2018 )، آغاز شد. هدف، طراحی پروتکل جدیدی بود که قادر به تولید محصولات دارویی پیشرفته (ATMP) برای ترمیم اعصاب محیطی بود. پنج فرد بالغ سالم- که تحت یک توربینوپلاستی یا سپتوپلاستی تحت بیهوشی عمومی قرار گرفتند- وارد شدند. برای هر فرد، یک بیوپسی مخاط بویایی و یک نمونه خون (برای مطالعات ژنتیکی) برداشت شد.
معیارهای خروج: آسیب شناسی سیستم عصبی مرکزی، زنان حامله یا شیرده، رینوسینوزیت مزمن یا عفونت حاد رینوسینوسال، درمان ضد ترومبوز، حساسیت به بی حس کننده های موضعی نوع آمید یا به یکی از مواد کمکی آنها، درمان جراحی قبلی روی شاخک های اتموئید و/یا متوسط افراد مبتلا به پورفیری یا صرع کنترل نشده (منع مصرف برای استفاده از زایلوکائین و نافازولین)، رادیوتراپی قبلی سرویکس یا انسفالیک، مثبت بودن سرولوژی های ویروسی (VIH 1، VIH 2، VHB، VHC، HTLV1) یا ناهنجاری های هموستاز (بر روی آثار خون).
سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی
به منظور مقایسه، دو بیوپسی مشابه، که در یک مکان در داخل حفره بینی همان اهداکننده جمع آوری شده بودند، به موازات دو روش شرح داده شده در بالا کشت شدند. تکرارپذیری بین اهداکننده با استفاده از بیوپسی بینی 2 یا 3 اهداکننده برای هر کشت ارزیابی شد. نرخ تکثیر با اندازه گیری زمان دو برابر شدن در روز 5 ارزیابی شد. تمام آزمایش ها در سه نسخه یا در دو نسخه انجام شد.
سنجش عقیمی و میکروبی زیر با استفاده از مایع رویی هر کشت OE-MSC انجام شد:
کشت خون هوازی و بی هوازی، ارزیابی حضور میکروب ها
سنجش کدورت سنجی برای تعیین حضور اندوتوکسین ها.
پایداری ژنتیکی سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی: سلول های بنیادی اکتو مزانشیمی بویایی (OE-MSCs) ساخته شده با PL100 پرتودهی شده از نظر پایداری ژنتیکی با استفاده از دو روش سیتوژنتیک مورد ارزیابی قرار گرفتند: کاریوتیپ معمولی و آرایه-CGH (هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای)
سنجش تمایز عصبی
ما آزمایشهایی را در شرایط آزمایشگاهی با رده سلولی نوروبلاستوم Neuro2a (N2a) موش انجام دادیم تا اثرات نوروتروفیک محیطهای شرطی شده با OE-MSC را ارزیابی کنیم.
کشت رده سلولی Neuro2a: Neuro2a (N2a) یک رده سلولی موشی مشتق از تاج عصبی است که برای مطالعه تمایز عصبی، رشد آکسون و مسیرهای سیگنالینگ عصبی استفاده می شود.
آمار
تمامی داده ها به صورت میانگین SEM ارائه شده و با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism6 تجزیه و تحلیل شدند.
نتایج
تولید ایمن و بسیار کارآمد سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی
هضم آنزیمی با سرعت بیشتری تعداد سلول های بیشتری را فراهم می کندهمانطور که در گزارش آمده است.
سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی کشت شده، دارای تکثیر بالا هستند و نگهداری از آنها، بازآرایی کروموزومی را القا نمی کند. تمام کشت های نهایی استریل بودند. سلول های بنیادی مزانشیمی OE-MSC فعالیت خود-بازسازی بالایی را نشان می دهند.
سلول های خالص شده نشانگرهای شناخته شده سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی را بیان می کنندهمانطور که انتظار می رود، سلول های بنیادی مزانشیمی OE-MSC برای CD31، CD34 و CD45- نشانگرهای شناخته شده سلول های بنیادی خونساز- منفی و برای CD90 و CD146- نشانگرهای سطحی سلول های بنیادی بویایی- مثبت هستند.
بحث
فرآیند تولید ایمن تر و کارآمدتر برای سلول های بنیادی بویایی درجه بالینی
کارآزماییهای بالینی، مبتنی بر محصولات دارویی تحقیقاتی، نیازمند تولیدی است که با «دستورالعملهای عملکرد خوب تولید ویژه محصولات دارویی درمان پیشرفته» مطابقت داشته باشد.
جداسازی آنزیمی برای تولید سریعتر سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی انسان کارآمدتر است.
محیط تهویه شده با سلول های بنیادی اکتومزانشیمی بویایی، درجه ی بالینی تمایز نورونی را تقویت می کند
در دو مطالعه قبلی بر روی مدلهای موش آسیب عصبی محیطی، ما کارایی OE-MSCs را در بهبود بهبود عملکرد حرکتی اندام تحتانی یا صورت نشان دادیم ( Bonnet et al., 2020 ; Alvites et al., 2022 ). برای ارزیابی اینکه آیا OE-MSCهای کشت شده با درجه بالینی باعث تحریک رشد مجدد آکسون از طریق فاکتورهای اکسترود شده می شوند، یک رده سلولی N2a با مخلوط 50:50 از محیط تمایز تازه و محیط شرطی شده از یک کشت 24 ساعته یا 48 ساعته کشت داده شد.
دکتر سید سلمان فاطمی . نورولوژیست, [03/09/2024 12:13 ق.ظ]
مطالعه قبلی نتایج مشابهی را با محیط شرطی شده OE-MSC درجه غیر بالینی نشان داد. Alvites و همکارانش ( Bense et al., 2020 ) نشان دادند که محیط شرطی شده با OE-MSC باعث بهبود عملکرد در موش های مبتلا به آسیب عصب سیاتیک می شود. آنها دریافتند که 48 ساعت OE-MSC-CM در مقابل 24 ساعت OE-MSC-CM حاوی سیتوکین ها، فاکتورهای رشد و عوامل نوروتروفیک مفید برای بازسازی اعصاب محیطی است. در مطالعه نشان میدهیم که تنها 48 ساعت OE-MSC-CM اثر آماری معنیداری بر تمایز عصبی N2a ایجاد میکند. این نتیجه احتمالاً با کیفیت مولکول های آزاد شده توسط OE-MSC مرتبط است. در محیط شرطی شده OE-MSC، غلظت بالایی از عوامل - به عنوان مثال، MCP-1، IL-1، IL-10، VEGF - نقش اصلی را در فرآیند بازسازی و عملکرد سلول های شوان ایفا می کنند. برای جامع بودن، باید به مطالعه دیگری بر اساس عوامل ترشح شده از سلول های بویایی، واقع در نوروپیتلیوم و نه لامینا پروپریا مخاط بویایی اشاره کنیم. مشاهده شده است که عوامل ترشح شده توسط سلول های بنیادی/پیش ساز عصبی (احتمالا ترکیبی از سلول های پایه اپیتلیال و نورون های نابالغ) باعث تمایز آستروسیتی سلول های پیش ساز عصبی هیپوکامپ موش بالغ می شود ( Gómez-Virgilio et al., 2018 ). از جمله عوامل ترشحی که به نظر می رسد در تمایز سلولی نقش دارند، می توان به اینترلوکین 6، نوروتروفین 4 و EGF اشاره کرد.
مزایای درمانی بالقوه OE-MSCها همچنین در مدل های حیوانی آسیب های مختلف که بر سیستم عصبی محیطی یا مرکزی تأثیر می گذارند، آزمایش شد. نتایج امیدوارکنندهای در مدلهایی گزارش شده است که برخی از علائم/مکانیسمهای مشاهدهشده در بیماری آلزایمر ( هنگ و همکاران، 2022 )، بیماری پارکینسون ( مورل و همکاران، 2008 ؛ فرهادی و همکاران، 2021 ؛ سیمرغ و همکاران، 2021) را تکرار میکنند. )، بیماری هانتینگتون ( بیات و همکاران، 2021 )، مولتیپل اسکلروزیس ( لیندسی و همکاران، 2010 ، 2022 ؛ وو و همکاران، 2013 )، آتاکسی مخچه ( مقدم و همکاران، 2022 ) سکته مغزی ایسکمیک ( لیو). ، 2020 ؛ ژو و همکاران، 2021 )، آسیب نخاعی ( لیندسی و همکاران، 2017 ؛ استامگنا و همکاران، 2018 ؛ ورونوا و همکاران، 2020 ؛ حمیدآبادی و همکاران، 2021 )، آمنسیا ، 2011 )، کاهش شنوایی ( پاندیت و همکاران، 2011 ). با توجه به مکانیسمها، گزارش شده است که OE-MSCها عوامل تغذیهای ترشح میکنند، پاسخ التهابی را تعدیل میکنند، انکلوزیون فاگوسیتها یا مولکولهای مضر و استرس اکسیداتیو را تنظیم میکنند.
نتیجه
مطالعه ی حاضر، یک پروتکل جدید ابداع شده برای خالص سازی و شناسایی OE-MSCهای انسانی را گزارش می دهد. فرآیند تولید مطابق با قوانین و دستورالعملهای آژانسهای بهداشتی ملی و اروپایی است و سلولهای تولید شده را میتوان به عنوان فرآوردههای دارویی پیشرفته درمانی (ATMP) در نظر گرفت که بالقوه قابل استفاده در کارآزماییهای بالینی است. علاوه بر این، ما در شرایط آزمایشگاهی نشان میدهیم که محیط شرطی شده با OE-MSC یک القاکننده قوی تمایز عصبی است.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9713000/
https://www.intechopen.com/chapters/73650
آدرس مطب : اصفهان ، خیابان آمادگاه ، روبروی داروخانه سپاهان ، مجتمع اطبا ، طبقه اول
تلفن : 32223328 - 031